一、酶聯免疫吸附試驗診斷技術

目前，該項技術已在獸醫學上得到廣泛的應用，大多數動物傳染病都已經研制成ELISA檢測方法。

1、酶聯免疫吸附試驗的原理

ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結果，使測定方法達到很高的敏感度。

2、ELISA的類型

根據試劑的來源和標本的情況以及檢測的具體條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。用于動物疫病檢測的ELISA主要有以下幾種類型：

.雙抗體夾心法測抗原

雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法。在臨床檢驗中，此法適用于檢驗各種蛋白質、微生物病原體第二價或二價以上的大分子抗原，但不適用于測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心。例如豬瘟病毒檢測ELISA、禽流感病毒抗原捕獲ELISA，就是根據這種原理設計的。

.雙抗原夾心法測抗體

反應模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結合物，以檢測相應的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體。乙肝HBs的檢測常采用本法。本法關鍵在于酶標抗原的制備，需要根據抗原結構的不同，尋找合適的標記方法。

此法中受檢標本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于于間接法。此外，該方法不受被檢動物種屬差異的限制。

.間接法測抗體

間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標記的抗體（抗免疫球蛋白抗體），檢測與固相抗原結合的受檢抗體（見圖1）。操作步驟如下：

（1）將特異性抗原與固相載體聯結，形成固相抗原。洗滌除去未結合的抗原及雜質。

（2）加稀釋的受檢血清，保溫反應。血清中的特異抗體與固相抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的其他成份在洗滌過程中被洗去。

（3）加酶標抗抗體 可用酶標抗人Ig以檢測總抗體，但一般多用酶標抗人IgG檢測IgG抗體。固相免疫復合物中的抗體與酶標抗體抗體結合，從而間接地標記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量與標本中受檢抗體的量正相關。

（4）加底物顯色

本法主要用于對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。間接法的優點是變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。

間接法在動物疫病抗體檢測中應用廣泛，例如禽流感的間接ELISA，用禽流感病毒NP蛋白包被成抗原板，待檢血清中的抗體與之結合，再加酶標二抗反應，可以檢測所有A型禽流感病毒抗體。

.競爭法測抗體

當抗原材料中的干擾物質不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。其原理為標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭固相抗原。標本中抗體量越多，結合在固相上的酶標抗體愈少，因此陽性反應呈色淺于陰性反應。

.競爭法測抗原

小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以采用競爭法模式。其原理是標本中的抗原和固相抗原共同競爭一定量的酶標抗體。標本中抗原量含量愈多，結合到固相上的酶標抗體愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。

例如，豬瘦肉精的檢測，多用瘦肉精抗原包被反應板，讓樣品中的瘦肉精抗原和板上的抗原共同競爭酶標單克隆抗體。

目前，已有商品化、標準化的試劑盒，可檢測豬瘟、豬偽狂犬、豬藍耳病、豬乙型腦炎、豬細小病毒、豬圓環病毒、豬弓形蟲、豬喘氣病等各種抗體。

（二）瓊脂擴散試驗

1、基本概念

沉淀反應：是利用可溶性抗原與抗體結合，形成肉眼可見的沉淀的一類血清學免疫反應 。抗原可以是多糖、蛋白質、類脂等。如細菌內毒素、外毒素、菌體裂解物，病毒懸液、病毒的可溶性抗原、血清、組織浸出液等。沉淀試驗包括絮狀沉淀試驗、瓊脂擴散試驗、免疫電泳。

瓊脂擴散試驗：是一種運用沉淀反應原理進行獸醫診斷檢測的一種常規實驗方法。

2、基本原理

瓊脂擴散試驗是利用抗原抗體能在瓊脂凝膠中自由擴散，并在瓊脂中結合，在一定比例處凝聚形成沉淀線，從而對抗原或抗體進行的測定、比較、鑒定和檢測。該方法具有簡便易行的特點，不需使用大量昂貴儀器設備，易于操作而被廣泛采用。瓊脂擴散試驗分為四種類型：單向單擴散、單向雙擴散、雙向單擴散、雙向雙擴散。其中應用最廣的是雙向單擴散和雙向雙擴散，雙向單擴散主要用于對抗原抗體的定量測定，雙向雙擴散主要用于對抗原的比較，以及抗原抗體的檢測。

雙向雙擴散簡稱雙擴散，即抗原抗體在瓊脂中相互擴散，各自產生一個擴大的環，兩環相遇時，在比例適當處，產生一條致密的白色沉淀線。這條沉淀線同時能阻止相同的抗原、抗體成分的繼續擴散。

根據所用試劑及檢測對象的不同，雙擴散又分為兩類，一類利用已知抗原檢測抗體，即血清流行病學調查，如禽流感、藍舌病、口蹄疫、牛白血病、馬傳貧、非洲馬瘟、禽霍亂等，另一類是利用己知抗體檢測抗原，如馬立克羽髓抗原的檢測。

（三） 凝集試驗

凝集試驗是顆粒性抗原（如細菌、紅細胞等）或表面載有抗原的顆粒狀物質（如聚苯乙烯膠乳、紅細胞、碳素顆粒等），與相應抗體在電解質存在下，結合出現肉眼可見的凝集（agglutination）現象的試驗。

凝集試驗是一個定性的檢測方法，即根據凝集現象的出現與否判定結果陽性或陰性；也可以進行半定量檢測，即將標本作一系列對倍稀釋后進行反應，以出現陽性反應的最高稀釋度作為滴度。由于凝集反應方法簡便，敏感度高，迄今已成為通用的免疫學試驗，廣泛應用于臨床檢驗。

凝集反應可分為直接凝集反應和間接凝集反應兩大類。間接凝集試驗中的間接血凝試驗和乳膠凝集試驗應用最為廣泛。

1、直接凝集反應

細菌、螺旋體和紅細胞等顆粒抗原，在適當電解質參與下可直接與相應抗體結合出現凝集，稱為直接凝集反應（direct agglutination）。凝集反應中的抗原稱為凝集原（agglutinogen），抗體稱為凝集素（agglutinin）。直接凝集試驗可分為玻片法、平板法、試管法及微量凝集法等。

2、間接凝集反應

將可溶性抗原(或抗體)先吸附于適當大小的顆粒性載體的表面，然后與相應抗體(或抗原)作用，在適宜的電解質存在的條件下，出現特異性凝集現象，稱間接凝集反應(indirectagglutination)或被動凝集反應（passiveagglutination）。這種反應適用于各種抗體和可溶性抗原的檢測，其敏感度高于沉淀反應，因此被廣泛應用于臨床檢驗。

在間接凝集反應中，可用作載體的顆粒種類很多，常用的有動物或人紅細胞、細菌和多種惰性顆粒如聚苯乙烯膠乳(polystyrenelatex）、活性炭、皂土（bentonite）、脂質體等，根據所用載體不同，間接凝集試驗又可稱為間接血凝試驗、膠乳凝集試驗、炭凝集試驗、皂土凝集試驗、脂質體凝集試驗等。

間接凝集反應具有快速、敏感、操作簡便、無需特殊的實驗設備等特點，而且能用于抗原或抗體的測定，因此在臨床檢驗中廣為應用。下面重點介紹最常用的間接血凝試驗和膠乳凝集試驗。

間接血凝試驗

以紅細胞作為可溶性抗原的載體來檢測抗體，稱為間接血凝試驗（IHA），也稱被動血凝試驗（PHA）。如將抗體吸附（致敏）在紅細胞上用于檢測抗原，則成為反向間接血凝試驗。

該方法具有許多優點：如敏感性高，特異性強，重復性和穩定性好，操作簡便，反應迅速，即可以定性又可以半定量，而且試劑價格低廉，不需要特殊復雜的儀器設備等。但是紅細胞凝集易受到如紅細胞的來源，致敏條件和操作技術等多種因素的影響，同時標本中的雜質、細菌污染和類屬抗原等又常引起非特異性凝集反應，因此，試驗時必須精心操作，注意防止污染，并設置相應對照。

間接血凝試驗在臨床檢驗中應用廣泛，可用于口蹄疫、豬瘟以及弓形體病等病的抗體的檢測。反向間接血凝試驗還可應用于口蹄疫病毒的檢測和定型以及水皰病病毒抗原、豬傳染性胃腸炎病毒抗原和小鵝瘟病毒抗原等的檢測。

膠乳凝集試驗

膠乳凝集試驗也是一種間接凝集試驗，所用的載體顆粒為聚苯乙烯膠乳，是一種直徑約為0.8μm大小的圓形顆粒，帶有負電荷，可物理性吸附蛋白分子，但這種結合牢固性差。也可制備成具有化學活性基團的顆粒，如帶有羧基的羧化聚苯乙烯膠乳等，抗原或抗體以共價鍵交聯在膠乳表面。化學交聯一般通過縮合劑碳化二亞胺將膠乳上的羧基與被交聯物上的氨基縮合在一起。這種用交聯致敏的膠乳試劑性能穩定，保存期長。

膠乳凝集試驗分試管法與玻片法。試管法先將受檢標本在試管中以緩沖液作倍比稀釋，然后加入致敏的膠乳試劑，反應后觀察膠乳凝集結果。玻片法操作簡便，一滴受檢標本和一滴致敏的膠乳試劑在玻片上混勻后，連續搖動2～3min即可觀察結果。出現凝集大顆粒的為陽性反應，保持均勻乳液狀為陰性反應。膠乳為人工合成的載體，因此其性能比生物來源的紅細胞穩定，均一性好。但膠乳與蛋白質的結合能力以及凝集性能不如紅細胞，因此作為間接凝集試驗，膠乳試驗的敏感度不及血凝試驗。

膠乳凝集試驗可用于豬偽狂犬病、細小病毒病以及乙型腦炎等病的檢測